真菌毒素及其检测方法的研究进展

  发布时间: 2010-04-12   信息员:   
 真菌毒素(Mycotoxin)是真菌产生的次级代谢产物,目前已知有200多种不同的真菌毒素。国内对真菌毒素及其检测方法的研究主要是由卫生部门,特别是由食品卫生部门组织进行的,最终要通过技术立法建立有关的国家标准及有效执法,对危害严重的真菌毒素逐步实现有效监控,以完善我国的卫生保障体系,为进一步提高人民的健康水平做出贡献。所以研究较为深入的对象集中在十几种对人类危害大的真菌毒素,它们一般同时具有毒性强和污染频率高的特点,其中包括黄曲霉毒素,主要是黄曲霉毒素B1和M1(Aflatoxins,FB1、FM1);赭(棕)曲霉毒素A(OchratoxinA,OA);杂色(柄)曲霉毒素(Terigmatocystin);展青霉素(Patulin,PTL);玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN(F-2));串珠镰刀菌素(Moniliformin,MF),三硝基丙酸以及属于单端孢霉烯族化合物(Trichothecenes)的T-2毒素(T-2toxin,T-2);脱氧雪腐镰刀菌烯醇(呕吐毒素)(Deoxynivalenol,DON);二乙酰镳草镰刀菌烯醇(Diacetoxyscirpenol,DAS)等。由于真菌的寄生和真菌毒素的产生,严重影响农作物的产量,降低农产品和饲料品质,造成巨大经济损失。据信,全世界每年由于霉变污染真菌毒素引起的农产品和工业原料的损失达数百亿美元。我国谷物霉变主要发生在北纬31°线即长江以南地区,每年使粮食减产3~7%。1973年,小麦赤霉病大流行,穗发病率50%以上,产量损失10~40%。据调查,除粮食、饲料以外,在油料作物种子、水果、干果、蔬菜、调味品、烟草、麻类、乳和乳制品、鱼虾、肉类、发酵产品等都发现了不同程度的真菌毒素污染。根据作用的靶组织分类,真菌毒素可分为肝脏毒、肾脏毒、心脏毒、造血器官毒等。人或动物摄入被真菌毒素污染的农、畜产品,或通过吸入及皮肤接触真菌毒素可引发多种中毒症状。如致幻,催吐,出血症,皮炎,中枢神经受损,甚至死亡。动物试验和流行病学的调查结果还证实,许多真菌毒素还可在体内积累后产生致癌、致畸、致突变、类激素中毒,白细胞缺乏症等,对机体造成永久性损害。某些癌症以及克山病等都与真菌毒素中毒有关。据不完全统计,自1972年至1987年,我国北方地区13个省发生食用变质甘蔗中毒病案825例,死亡78人,其中河北乐亭一次中毒死亡8人,而且相当比例的重病人遗留终生残疾。经刘兴介、罗雪云、胡文娟等5年多的研究证实是节菱孢产生的三硝基丙酸中毒。1989年5月在内蒙古哲里木盟扎鲁特旗,由于居民食用玉米赤霉烯酮污染的荞麦造成乳腺病暴发,累计发病103例,患病率14.49%。在消化道癌高发区的河南林县,经流行病学调查发现,人们摄食中的DON、T-2毒素等含量与食管癌、贲门癌的发病率呈正相关。1986年以来,郭可大、李季伦、刘兴介等人的研究、调查证明串珠镰刀菌素可能是克山病的主因,该项研究目前仍在进行。

  在所有真菌毒素中,黄曲霉毒素B1的毒性、致癌性、污染频率均居首位。黄曲霉毒素B1是已知毒性最强的天然物质,敏感动物(鸭雏经口)的LD50=0.294mg/kg,比氰化钾的毒性高10倍。对AFB1致癌致突变机理的研究证实,AFB1可由肝微粒体酶活化为亲电子的AFB1-2,3环氧化物,这种环氧化物的C2与DNA的鸟嘌呤酮基结合形成AFB1-DNA加合物,再经去嘌呤反应形成AFB1-N7-鸟嘌呤,使DNA分子产生无嘌呤位置的缺口,最终造成DNA损伤。1987年,国际癌症中心将黄曲霉毒素定为人类有足够证据的致癌剂。一般真菌毒素都非常稳定,在烹调过程中不会被破坏,以下是部分真菌毒素的熔点。黄曲霉毒素B1是已知各种真菌毒素中最稳定的一种。结晶的AFB1在高温(200℃)及紫外线照射下都不被破坏,在1kg/cm2条件下,4小时后仅破坏1/20,在pH1-3的强酸性溶液中稍有分解。在pH9-10的强碱性溶液中能迅速分解,但此反应可逆,即在酸性条件下又能恢复原来结构。用5%次氯酸钠和丙酮可使AFB1完全分解,在实验室中用此方法对器皿作解毒处理。国外运用现代科学技术手段对真菌毒素进行认真系统的研究是从1960年开始的。1960年6月至8月间,英格兰南部及东部地区死亡10万只火鸡,解剖见肝脏出血及坏死,肾脏肿胀。组织学检查发现肝实质细胞退行性变及胆管上皮细胞广泛增生。当时病因不明,称为“火鸡X病”。经过2年多的研究调查,从饲料中巴西进口的花生饼粉中分离出黄曲霉,进一步研究,发现正是黄曲霉产生的一种荧光物质造成火鸡的死亡,并将其命名为黄曲霉毒素(Aflatoxin)。其后许多学者证明黄曲霉毒素不但引发急性中毒症,而且长期少量食用可引起实验动物的癌症。这一结果被广泛重视,并由此带动了对食品中常见真菌代谢产物的研究,在食品毒物学方面开辟了新的领域。1966年WHO/FAO首次规定了食品中黄曲霉毒素的最高允许量。1973年10月,WHO/FAO召开的化学污染会议将黄曲霉毒素的研究,列为16个优先研究项目中的首要项目。1976年10月在美国马里兰州召开第一届国际真菌毒素会议,29个国家和地区的代表与会,会议对黄曲霉毒素研究的动向进行了重点介绍和讨论。1987年,WHO/FAO/UNEP在泰国曼谷召开第二届国际真菌毒素会议,会上已经统计到56个国家控制真菌毒素污染的立法情况。除了对黄曲霉毒素普遍提出了控制标准,许多国家还制订了DON、OA、T-2、ZEN、PTL等真菌毒素的最高允许量标准。1975年,英国剑桥大学分子生物学研究室的Kohler和Milstein发表了著名论文“分泌预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”,为用B淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体的细胞工程新技术奠定了基础,并以此荣获1984年诺贝尔医学、生理学奖。以单克隆抗体建立的酶联免疫吸附测定方法(ELISA),具有敏感、特异、稳定、简便的优点,非常适合真菌毒素的检测,美、英、德、日等国很快竟相开展这方面的研究。1977年即有抗黄曲霉毒素B1的单克隆抗体问世。时至今日,几乎所有重要真菌毒素的单克隆抗体免疫检测方法均已建立。1970年以后,由于国际上对真菌毒素研究的进展和外贸部门提出必须对进出口粮食提交真菌毒素的分析报告,卫生部开始将真菌毒素及其检测技术的研究列入重点科研项目。1972年至1974年由中国医学科学院卫生研究所组织各省市卫生防疫站及有关院校对22个省、市、自治区的粮油食品中的AFB1含量进行普查,采集、分析了约3万份样品。综合此次普查和毒理实验结果并参照国际通行标准,1975年全国食品卫生工作会议提出了我国第一份有关真菌毒素的强制性法规-AFB1最高允许量试行标准,经过几年试行,于1978年6月1日作为国家标准(GB2761-81)正式实施。鉴于1973年全国小麦赤霉病的特大流行,卫生部组织了由江苏、上海等8省市参加的赤霉病麦科研协作组,对赤霉病麦中毒的病原菌、真菌毒素及检测方法,动物毒性试验及卫生标准进行了广泛研究,分离出脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮等3种真菌毒素。近年来,有关单位对杂色曲霉毒素、赭曲霉毒素A、三硝基丙酸、串珠镰刀菌素、黄曲霉毒素M1以及丁烯酸内酯等真菌毒素先后进行了研究和区域性污染调查。由于我国传统饮食习惯中谷物比例大大高于西方,使得真菌毒素的危害更为突出。如在70年代全国普查中发现在我国北纬31°线以南地区采集的玉米、花生、花生油样品的阳性检出率为22.9~68.1%。1973年,湖北省黄岗、天门等10县发生赤霉病麦中毒3000余人,安徽省也有200余人中毒。1991年安徽、河南部分地区因特大洪涝灾害造成粮食霉变而在灾区农民中引起较大范围的真菌毒素中毒,一些地区的发病率超过70%。霉变小麦样品中,T-2毒素的污染阳性率为96.9%。我国卫生工作者及有关部门经过多年持续不断的努力,对真菌毒素的研究和污染控制已取得明显进展。近年来,暴发性真菌毒素中毒已很少发生,某些与真菌毒素中毒密切相关的疾病也基本得到控制。如通过对变质甘蔗中毒的研究,搞清了病原菌及致病毒素后,采取了地区禁运、禁售的措施,北方地区已很少有甘蔗出售,三硝基丙酸中毒也得到控制。近年来,在克山病原病区如黑龙江、内蒙古、陕西等省区已很少发病。农村改革以后,产粮户直接到粮站售粮,而霉变粮食是不准交售的,因此,粮食的生产者和经营者的责任心都有所提高。据国家粮食储备局最近提供的情况,目前即使在南方各省,也很难见到黄曲霉毒素B1超标样品。但是,由于经济社会发展状况的原因,我国目前对真菌毒素的卫生监控工作无论立法还是执法的水平都还与国外先进国家存在差距。真菌毒素卫生监控的立法即国家标准的建立由两方面组成:一是建立真菌毒素检测方法的国家标准,主要为真菌毒素允许量国家标准的建立和卫生防疫部门的执法、粮油食品和饲料贸易的货物品质分析以及对引起真菌毒素中毒的污染物进行病因分析提供技术手段。二是建立食品和饲料中真菌毒素的允许量国家标准。这类标准属于强制性执行的法规,在制订过程中除了依据毒理实验的结果,还必须进行相当规模的毒素污染调查,以确保所订指标切合实际,与国家农业生产,食品、饲料供应的承受能力相符。在黄曲霉毒素B1允许量国家标准的制订中就体现出这种矛盾。AFB1是强剧毒性、强致癌性物质。单纯从毒理学的观念看待食品中的AFB1,检出即视为有毒,但也只能根据普查的实际情况,暂时按照目前规定的标准执行。当然,国外也存在同样问题。1966年至1975年间,WHO/FAO就连续3次修订了食品中黄曲霉毒素最高允许量标准,将其从30ppb逐步降低至15ppb。欧盟则规定从1998年起进口花生原料中的黄曲霉毒素限量由20μg/kg,花生制品由10μg/kg统一降至4μg/kg。即时将对黄曲霉毒素超标的花生出口国自动关闭欧盟15国市场。在这两类有关真菌毒素国家标准的制订工作中,建立检测方法的工作进展较快。我国从1989年开始进行真菌毒素免疫检测方法国家标准的研究,至今已建立了黄曲霉毒素B1等7种真菌毒素的免疫检测方法,其中有些已经正式颁布实施,有些在审批过程中,其它重要的真菌毒素也有化学法等检测手段。在国内非临床检验试剂中,真菌毒素的检测首先引入了单克隆抗体免疫技术。它的发展还促进了对其它生物毒素的研究,如河豚鱼毒素免疫检测方法的建立。但是,真菌毒素允许量国家标的制订仍然滞后。目前只有黄曲霉毒素B1、M1,脱氧雪腐镰刀菌烯醇、展青霉素等少数真菌毒素的允许量标准颁布实施。一些真菌毒素虽然已列入标准制订计划,但遇到很大困难。有关管理部门对无法直接产生经济效益的项目资金投入十分有限。而体制改革以后,在真菌毒素的污染普查工作中已很难无偿组织地方单位共同协作。由于尚有一些标准亟待建立,而且AFB1这样的非安全性标准也需要适时修订,所以有关真菌毒素立法的任务十分艰巨。真菌毒素的检测方法,主要是由各级各类卫生监督部门在执法过程中使用,如果相应的法规不配套,那么已经建立的真菌毒素检验方法也就失去了用武之地。;以下是国内几种真菌毒素检测方法的研究进展:1、黄曲霉毒素B1黄曲霉毒素B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物。即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)。前者为基本毒性结构,后者与致癌有关。;国内最早研究真菌毒素免疫检测方法的是中国医学科学院肿瘤研究所的孙宗棠,他于1983年建立了AFB1单克隆抗体放射免疫测定方法。1992年,中国科学院上海细胞所李永镛和上海医科大学公共卫生学院殷芬、俞顺章等人合作建立了AFB1单克隆抗体的酶联免疫检测方法。中国预防医科院营养与食品卫生研究所和江苏微生物所也先后建立了AFB1多克隆抗体的酶联免疫测定方法。北京市营养源研究所路戈与中国医科院肿瘤研究所王德斌和卫生部食品卫生监督检验所计融等人合作于1994年建立了规范的AFB1单克隆抗体酶联免疫检测方法,该法已列为国家标准(GB/T5009.22-1996)。在1985年以前,另有几种荧光色谱法列为国家标准(GB/T5009.23-1996;GB/T5009.24-1996)。其中薄层色谱法由卫生研究所和青岛商品检验局于1973年建立(GB/T5009.22-1996)。2、T-2毒素为剧毒(猪静注LD50=1.2mg/kg),具有明显的细胞毒,而且是体内蛋白质合成的抑制剂,有致畸性和致突变性。中毒后呕吐,腹泻,严重时损伤造血组织。T-2毒素的免疫检测方法由卫生部食检所阳传和、罗雪云、计融于1991年建立(GB/T14933-94),方法最低检出量为1ng/ml,敏感范围为4-1000ng/ml。这是首次采用免疫技术建立的检测真菌毒素的国家标准。3、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(呕吐毒素,DON)是较早(1970年)被分离提纯后命名的真菌毒素,毒性弱于T-2毒素,(小鼠经口LD50=9.2mg/kg)中毒症状类似,有明显的致吐作用。DON经对甲基苯甲醛喷雾后呈黄色,卫生部食检所魏润蕴于1986年建立了DON薄层层析检测方法(GB/T14929.5-1994)。DON免疫检测方法由卫生部食检所阳传和、计融于1992年建立,方法最低检出量为5ng/ml,敏感范围为5-1000ng/ml,该法已批准为国家标准(GB/T14929.5-1994)。小麦、面粉、玉米及玉米粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇限量标准已于1996年9月1日颁布实施(GB16329-1996),最高允许量为1000μg/kg4、二乙酰镳草镰刀菌烯醇(DAS)的毒性强于T-2毒素(猪静注LD50=0.367mg/kg),1992年,卫生部食检所李业鹏、罗雪云等用酶标记单克隆抗体建立了检测DAS的双抗夹心酶免疫斑点检验方法,最低检出量为10ng/ml,敏感范围为2-1000ng/ml。5、玉米赤霉烯酮(ZEN,F-2)是另外一种从赤霉病麦中分离出来的真菌毒素(化学名称为6-(10-羟基-6-氧基碳烯基)-β-雷锁酸-μ-内酯,分子量为318),主要污染小麦、大米、玉米、荞麦等谷物,是一种生殖系统毒素,有强烈致畸作用。ZEN在波长为254nm短紫外光照射下发出兰绿色荧光,卫生部食检所罗雪云、胡霞于1992年建立ZEN薄层层析分析方法,最低检出量为50μg/kg。1993年中国农科院兰州兽医所王景琳、张志东等建立了ZEN单克隆抗体酶联免疫检测方法,最低检出量为0.3ng/ml。1995年,北京市营养源研究所路戈等也建立了ZEN单克隆抗体免疫检测方法,最低检出量为1ng/ml,敏感范围5-1000ng/ml,该法已通过国家标准审查。6、赭曲霉毒素A(OA)主要表现为很强的肾脏毒(大鼠经口LD50=20mg/kg)并有致畸性和致癌性,污染的谷物主要为麦类及玉米。在紫外光下赭曲霉毒素A呈绿色荧光,卫生部食检所于1991年建立了OA薄层层析分析方法,已列入国家标准(GB13111-91)。1992年该所阳传和、罗雪云等又建立了OA单克隆抗体免疫检测方法,也已经被批准为国家标准。7、黄曲霉毒素M1(AFM1)是AFB1经动物代谢产生的衍生物,可以从内脏、尿和乳汁中测出。尿或乳汁中排出的AFM1的量约为摄入AFB1量的1%。AFM1的毒性(鸭雏经口LD50≈0.32mg/kg)仅次于AFB1,致癌性也相似。因此乳及乳制品中AFM1的污染控制是食品卫生工作的重要环节。我国规定牛乳中AFM1的含量不得超过0.5μg/kg,乳制品按实际含乳量折算(GB9676-88)。1980年卫生研究所胡文娟、韩玉莲(AFM1在波长365nm紫外光照射下呈兰紫色荧光)建立了检测几种主要动物性食品中AFM1的薄层层析法,最低检出量为0.1~0.5μg/kg(GB/T5009.24-1996)。1992年中国预防医科院营养与食品卫生研究所的刘兴介等人利用美国威斯康星大学朱繁生教授提供的单克隆抗体应用ELISA直接竞争法测定了97份乳粉样品中的AFM1含量。(阳性率84.5%,超标率39.2%,最高4.16ng/g)1996年,卫生部食检所李燕俊、计融开始研究AFM1的免疫检测技术,目前主要工作已经完成。8、杂色曲霉素(柄曲霉素,分子量324)是一种很强的肝及肾脏毒素。可导致胆管癌和肝癌,有致突变性,但对食品的污染频率较低。杂色曲霉素经三氯化铝喷雾后加热,可在365nm波长紫外光下呈黄色荧光。卫生研究所建立的检测杂色曲霉素的薄层色谱法已于1984年列为国家标准(GB/T5009.25-1996)。该法对大米、玉米、小麦的最低检出量为25μg/kg,黄豆、花生为50μg/kg。9、展青霉素(PTL)有致癌性,也有致畸、致突变作用,在水果制品中的污染较为严重。1998年卫生研究所刘勇、胡文娟建立了苹果、山楂制品中展青霉素的薄层扫描测定法。该法于1994年列为国家标准,同时还规定了展青霉素的限量卫生标准(GB14974-94)。1992年吴南建立了用高效液相色谱法测定展青霉素的方法,最低检出量为2μg/kg。10、串珠镰刀菌素(MF)属剧毒物,有很强的心脏毒,中毒死亡后可见心肌坏死性病变,近年研究表明该毒素可能是克山病主因。串珠镰刀菌广泛污染粮食作物,其中对玉米的污染率较高。1984年,俞世荣、王玉华建立了串珠镰刀菌素的薄层及高效液相色谱测定法。以上是对近年来国内对真菌毒素检测方法研究进展基本情况的介绍,从中可以看出,目前取得的这些成果已经能够对真菌毒素的研究和真菌毒素污染的监督控制提供有效的技术支持,基本上达到了我们的目的。今后,有关真菌毒素的立法和宣传教育还有大量工作要做,特别是免疫检测方法还需要经过一段时间和推广,才能为基层工作者掌握。


文章出处:新华社